Μέθοδοι Λειτουργικής Ανάλυσης Βιολογικών Μακρομορίων

1. Λύση βακτηριακών κυττάρων που εκφράζουν αλκαλική φωσφατάση (3 ώρες) Δ. Δοκιανάκη (ΕΔΙΠ)

Λύση της βακτηριακής πάστας με λυσοζύμη και ανίχνευση της ενεργότητας του ενζύμου.

2. Καθαρισμός ενζύμου με χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής (3 ώρες) Δ. Δοκιανάκη (ΕΔΙΠ)

Χρωματογραφία με Q-Sepharose και ανίχνευση της ενεργότητας του ενζύμου.

3. Ταυτοποίηση ενζύμου με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμίδης (3 ώρες) Δ. Δοκιανάκη (ΕΔΙΠ)

Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμίδης και ανάλυση αποτελεσμάτων.

4. Συγκόλληση και κλωνοποίηση DNA (3 ώρες)   Δ. Δοκιανάκη (ΕΔΙΠ)

Συγκόλληση πλασμιδιακού φορέα με ένθεμα. Συγκόλληση θραύσματος DNA με προεξέχοντα άκρα για τη δημιουργία θραυσμάτων διαφορικού μοριακού βάρους και χρήση του σαν μοριακό δείκτη. Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης.

5. Μετασχηματισμός βακτηρίων (3 ώρες) Δ. Δοκιανάκη (ΕΔΙΠ)

Μετασχηματισμός δεκτικών βακτηρίων με την ligation και επιλογή σε τρυβλίο Petri με χρήση αντιβιοτικών. Χρήση UV για εντοπισμό έκφρασης της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης σε βακτήρια.

6. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (3 ώρες) Μ. Δραμουντάνη (ΕΤΕΠ)

Πειραματική προσέγγιση Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης, δοκιμασία των φοιτητών στην PCR και ηλετροφόρηση προιόντων PCR σε πήκτωμα αγαρόζης.

7. Μέθοδος κλωνοποίησης με χρήση γραμμικού-γραμμικού ομόλογου ανασυνδυασμού (linear–linear homologous recombination, LLHR) σε βακτήρια και θετική/αρνητική επιλογή (selection/counter-selection)―κασέτες αυτοκτονίας (3 ώρες) - [Δ. Παπαδόπουλος (ΔΕΠ) / Μ. Δραμουντάνη (ΕΤΕΠ)]

1) PCR για την δημιουργία ομόλογων άκρων στα ενθέματα και τον φορέα κλωνοποίησης

2) ccdA/ccdB, recombinases redα/redβ/redγ του φάγου λ, recombinase recA της E. coli, γυράση και μετάλλαξη gyrA(R462C)

3) καθαρισμός προϊόντων PCR και μετασχηματισμός βακτηρίων με τη μέθοδο της ηλεκτροδιάτρησης (electroporation)

4) επαγωγή recombination-proficient βακτηριακών κυττάρων με L-αραβινόζη και προετοιμασία κυττάρων για ηλεκτροδιάτρηση (electroporation)

5) θετική/αρνητική επιλογή κλώνων και ελαχιστοποίηση του θορύβου (background) με τη χρήση κασετών αυτοκτονίας

8. Επιλογή σωστών κλώνων ανασυνδυασμένου πλασμιδίου με τη μέθοδο colony-PCR  (3 ώρες) –

[Δ. Παπαδόπουλος (ΔΕΠ) - Μ. Δραμουντάνη (ΕΤΕΠ)]

1) Σχεδιασμός αντίδρασης PCR για τον εντοπισμό σωστών κλώνων

2) Επίστρωση κλώνων σε τρυβλίο Petri με τα κατάλληλα αντιβιοτικά

3) Αντίδραση PCR

4) Ηλεκτροφόρηση του προϊόντος της PCR σε gel αγαρόζης και συζήτηση των αποτελεσμάτων

9. Απομόνωση γενωμικού DNA από λευκά αιμοσφαίρια. (3 ώρες) Α. Παπαδάκη (ΕΔΙΠ)

Αιμοληψία στο ΠΑΓΝΗ από κάθε φοιτητή και επακόλουθη απομόνωση του γενωμικού DNA από το αίμα.

10. Υβριδοποίηση DNA κατά Southern / Microarrays  (3 ώρες) Α. Παπαδάκη (ΕΔΙΠ)

Ανάλυση και ανάπτυξη των τεχνικών.

11. Γονοτύπηση (3 ώρες) Μ. Δραμουντάνη (ΕΤΕΠ)

Ανάλυση γονοτύπων με 2 διαφορετικούς μικροδορυφορικούς τόπους. Ανάλυση χαρακτηριστικών γενετικών δεικτών και μικροδορυφόρων. Ανάλυση πειραματικής διαδικασίας, ανάλυση γονοτύπων, συχνότητα άλληλομόρφων, ποσοστό ετεροζυγωτίας γενετικού δείκτη, αξιολόγηση γενετικών δεικτών, ασκήσεις.